Синтезируем...

Контроль качества олигонуклеотидов

Перед применением синтетических олигонуклеотидов необходимо обязательно убедиться в чистоте полученного продукта, а также подтвердить его молекулярную массу.

Методы контроля качества при синтезе олигонуклеотидов

Перед применением синтетических олигонуклеотидов необходимо обязательно убедиться в чистоте полученного продукта, а также подтвердить его молекулярную массу. В зависимости от природы и применения олигонуклеотида необходимо определять разные примеси, что требует использования разнообразных методов.

На сегодняшний день для характеризации небольших количеств олигонуклеотидов, которые используются в диагностике (0.03-50 мг) применяются те же методы, что и для очистки – ионообменную (анионообменную) и обращено-фазовую ВЭЖХ (в том числе в ион-парном варианте), гель-электрофорез, в том числе капиллярный [1], а также масс-спектрометрия и флуориметрия.

Чистота олигонуклеотидов – это достаточно неоднозначный параметр, в значительной степени определяемый применяющимся методом анализа. Так, если мы рассмотрим для примера олигонуклеотид, содержащий остаток флуоресцеина (FAM) и условно проанализируем его разными методами, то получим разное содержание основного вещества. Например, если с помощью ОФ ВЭЖХ целевого олигонуклеотида будет 95%, то, как правило, ИО ВЭЖХ дает меньшее содержание – 90-92%, так как позволяет определить n-1 и n+1 примеси в олигонуклеотиде.

Также значимым параметром будет длина волны детекции – при 260 нм (поглощение нуклеотидов) и 470 нм (поглощение остатка флуоресцеина) чистота вещества будет разная. При этом детекция на обеих волнах дает значимую информацию – при 260 нм определяются примеси олигонуклеотидной природы, не содержащие красителя, а при 470 нм можно видеть все примеси с флуоресцеином (например, свободный краситель). Если подойти к вопросу формально и также определить содержание солей в образце, то содержание основного вещества вообще упадет до 60% и менее.

Гель-электрофорез дает результаты, схожие с ИО ВЭЖХ, однако значительно дешевле и позволяет параллельно анализировать большое количество проб. Но при этом количественно оценить полученные результаты можно только с большой натяжкой. Капиллярный гель-электрофорез значительно эффективнее и позволяет получать количественные результаты, но высокая цена оборудования и расходных материалов вкупе с невысокой информативностью результатов привела к тому, что сегодня этот метод практически вытеснен масс-спектрометрическим анализом.

Сегодня масс-спектрометрия биомолекул перестала быть экзотическим методом для работы со сложными природными объектами, а стала рутинным методом для контроля качества олигонуклеотидов. В результате такого анализа можно определить молекулярную массу олигонуклеотида, что, безусловно, напрямую не позволяет определить первичную структуру олигонуклеотида. Тем не менее, учитывая однозначность синтеза олигомерной цепи, результат совпадения экспериментальных данных с расчетной молекулярной массой подтверждает успешность синтеза. Кроме того, возможно определение примесей, которые делают невозможным использование олигонуклеотида в ряде применений. Например, детектируемое количество комбинаторного n-1 продукта в олигонуклеотиде, предназначенного для синтеза генов.

Принципиально возможно использование двух основных методов ионизации – MALDI (ионизация методом лазерной десорбции) [2,3] и ESI (электрораспылительная ионизация) [4,5]. Детекторы могут быть использованы самые разные – времяпролетные (TOF), квадруполи (Q), ионные ловушки (TRAP) и другие. Это связано с тем, что для выходного контроля качества олигонуклеотидов не нужна высокая чувствительность, и не требуется тандемная или n-мерная масс-спектрометрия для подтверждения структуры из-за сложности и индивидуальности спектра фрагментации для каждого олигонуклеотида. Последнее используется только для фармакологических субстанций на основе олигонуклеотидов (API) при синтезах сотен граммов или килограммов. Чаще всего используется MALDI TOF с линейным детектором (например, Microflex Bruker), ESI и ионную ловушку (Thermo LCQ) и ESI и гибридный тандемный квадруполь-времяпролетный детектор q-TOF (MicroTOF или Maxis Impact, Bruker). Это связано с тем, что кроме эффективности метода, необходима удобная программная оболочка для расчета массы олигонуклеотида, анализа полученных результатов и так далее, что особенно актуально при синтезе сотен и более олигонуклеотидов в сутки, а для этих приборов разработано удобное в использовании приложение, позволяющее эффективно анализировать получаемые данные.

Для коротких природных или модифицированных олигонуклеотидов (длиной до 40-50 нуклеотидов) оптимально использовать MALDI TOF масс-спектрометр, причем в качестве матрицы можно использовать как смеси на основе 3-гидроксипиколиновой кислоты, так и на основе 2,4,6-тригидроксиацетофенона. Для длинных олигонуклеотидов, олигонуклеотидов, содержащих красители, а также для количественного определения примесей, особенно присутствующих в незначительных количествах (до 5%) лучшим выбором будет электрораспылительная ионизация (ESI). Таким образом, масс-спектрометрический контроль качества синтеза олигонуклеотидов позволяет не только выбраковывать некачественные или ошибочные олигонуклеотидов, но и в целом отслеживать функционирование системы синтеза и очистки олигонуклеотидов.

Список литературы

  1. A. Smith, R.J.Nelson. Capillary Electrophoresis of DNA. Current Protocols Nucleic Acid Chem. 10.9.1-10.9.16 (2003).
  2. C.Pan, S.Xu, H.Zhou, Y.Fu, M.Ye, H.Zou. Recent developments in methods and technology for analysis of biological samples by MALDI-TOF-MS. Anal Bioanal Chem. 387 (1), 193-204 (2007).
  3. S.Sauer. The essence of DNA sample preparation for MALDI mass spectrometry. J. Biochem. Biophys. Methods 70 (2), 311-318 (2007).
  4. K.J.Fountain, M.Gilar, J.C.Gebler. Electrospray ionization mass spectrometric analysis of nucleic acids using high-throughput on-line desalting. Rapid Commun. Mass Spectrom. 18 (12), 1295-1302 (2004).
  5. B.Basiri, M.G.Bartlett. LC-MS of oligonucleotides: applications in biomedical research. Bioanalysis 6 (11), 1525-1542 (2014).

Наша технология работы

Научная база, накопленный опыт и техническое оснащение, позволяют быстро оптимизировать наши технологии под индивидуальные решения в области олигосинтеза.

Заказ
Оформление
Доставка

Контакты

Если вы хотите отправить нам сообщение, воспользуйтесь формой обратной связи или просто позвоните нам.

129085, Москва, ул. Годовикова, д.9, стр. 1, подъезд 1.4, помещение 1.12

+7 495 721-29-70, +7 929 692-58-64

info@genterra.ru

www.genterra.ru

Top