Синтезируем...

Процесс синтеза олигонуклеотидов

Основы для химического синтеза олигонуклеотидов были заложены еще в 50-ых годах прошлого века в работах А. Тодда и Х. Г. Корана.

Химический синтез олигонуклеотидов

Первоначально химический синтез нуклеиновых кислот проводился вручную и был крайне трудоемким и длительным процессом. Так, еще в начале 80-х годов, полный синтез 20-25 звенного олигонуклетида занимал несколько месяцев. Однако, растущие потребности в синтетических олигонуклеотидах привели к быстрой разработке и внедрению автоматических ДНК-синтезаторов [4]. Представленные в настоящее время на рынке ДНК-синтезаторы можно разделить на три категории - планшетные, колоночные и микрочиповые. Планшетные синтезаторы предназначены для параллельного синтеза разных олигонуклеотидов. Они отличаются количеством планшетов (от одного до восьми) и позволяют одновременно вести синтез от 96 до 768 олигонуклеотидов в масштабе от 10 наномоль до 5 микромоль. Среди представленных на рынке можно выделить синтезатор ASM-2000 (ООО «Биоссет»), Mermade 192 (Bioautomation) и Dr. Oligo (Biolytic). Колоночные синтезаторы отличаются меньшим количеством синтезируемых олигонуклеотидов (как правило, от 1 до 12 штук), однако могут обеспечивать большие масштабы синтеза. Примерами могут служить синтезатор MerMade 6&12 (Bioautomation), который позволяет синтезировать до 12 олигонуклеотидов в масштабе от 1 до 200 микромоль, АСМ-10 (Биоссет), а также серия OligoPilot 10, 100 и 400 (GE Healthcare) с возможностью синтеза в масштабе 1 микромоль - 60 ммоль. Также существуют синтезаторы, позволяющие получать сотни грамм олигонуклеотидов, предназначенных для клинических и фармацевтических исследований. Отдельным направлением являются синтезаторы, позволяющие вести синтез олигонуклеотидов непосредственно на поверхности микрочипов. Раньше такие синтезаторы не были представлены на рынке и можно было купить готовые микрочипы с иммобилизованными олигонуклеотидами, однако сегодня коммерчески доступны приборы компаний Flexgen и Сustom Аrray. Последний позволяет одновременно синтезировать от 2000 до 90000 олигонуклеотидов в количестве порядка 0.1 пмоль. Такие микрочипы после удаления защитных групп олигонуклеотидов могут непосредственно использоваться в геномных исследованиях или полученные пулы олигонуклеотидов можно удалять с микрочипа и использовать для синтеза протяженных генов [5].

В общем виде автоматический синтезатор представляет собой систему, состоящую из реакционной камеры, емкостей для реагентов, коммуникаций и клапанов для подачи реагентов под давлением инертного газа. При этом в реакционной колонке находится твердофазный носитель с иммобилизованным мономером, а последовательное добавление реагентов позволяет наращивать олигомерную цепочку без выделения и очистки промежуточных продуктов. В качестве твердой фазы используют высокопористое стекло (CPG) или полистирольные шарики. Исходные нуклеотидные мономеры химически присоединяются к поверхности твёрдой фазы с помощью специальных линкеров. Химическая природа линкеров такова, что они разрушаются под действием аммиака или метиламина, что позволяет после окончания синтеза легко отделить олигонуклеотиды от твёрдой фазы. Возможно использование стабильных линкеров, при этом после деблокирования олигонуклеотиды остаются иммобилизованными на твердофазном носителе, что актуально при синтезе на микрочипах.

Рисунок 1. А – синтезатор АСМ-2000
Б – синтезатор АСМ-10
В – синтезатор Mermade 6&12
Рисунок 2. Цикл олигонуклеотидного синтеза по амидофосфитной схеме.

В период с 50-х годов ХХ века были предложены несколько вариантов олигонуклеотидного синтеза: фосфодиэфирный, фосфотриэфирный, Н-фосфонатный (гидрофосфорильный) и амидофосфитный. Именно последний оказался наиболее эффективным и сегодня амидофосфитная схема синтеза олигонуклеотидов является практически единственной как в лабораторном, так и промышленном синтезе олигонуклеотидов. Амидофосфитные производные нуклеозидов были предложены М. Карузерсом и соавторами в 1981 году [6]. Амидофосфиты стабильны, но в присутствии слабых кислот быстро реагируют с гидроксигруппами нуклеозидов. Химическая структура стандартных амидофосфитных производных 2’-дезоксинуклеозидов изображена на рис. 2. Наличие дополнительных защитных групп необходимо для предотвращения протекания побочных реакций в процессе олигонуклеотидного синтеза.

Синтез олигонуклеотидов проводится путем пошагового присоединения амидофосфитных мономеров в направлении от 3’- к 5’-концу. Всего для присоединения одного мономера требуется совокупность из четырех химических реакций, которые составляют цикл синтеза: 1) стадия удаления 5’-диметокситритильной защиты, 2) стадия конденсации, 3) стадия кэпирования и 4) стадия окисления (рис. 2).

На первой стадии синтеза происходит удаление защитной DMT-группы с 5'-конца растущей цепи под действием раствора трихлоруксусной (или дихлоруксусной) кислоты в хлористом метилене. Неполное удаление DMT-группы чревато накоплением так называемого n-1 олигонуклеотида, который на одно звено короче, чем целевой и при этом является полностью комбинаторным по составу. Наличие такой примеси нежелательно для всех применений, но особенно критично не допускать ее появления при последующем использовании олигонуклеотидов для синтеза генов.

На второй стадии происходит присоединение амидофосфитного производного нуклеозида к свободной 5'-гидроксигруппе. Реакция протекает в присутствии слабой кислоты, например, 2-этилтиотетразола (ETT) или 4,5-дицианимидазола (DCI), в ацетонитриле. Высокая реакционная способность амидофосфитных производных обеспечивает как быстрое протекание реакции (30 секунд), так и высокую степень превращения - 99.5-99.9%. Стадия конденсации весьма чувствительна к следовым количествам влаги (содержание воды не должно превышать 0.001-0.005%) и кислорода (реакция всегда проводится в атмосфере сухого аргона или азота). Также недопустимо наличие следовых количеств уксусной кислоты. Однако степень превращения всегда будет меньше 100% и с ростом синтезируемой цепи выход олигонуклеотида снижается. Причем именно степень превращения на этой стадии определяет не только выход, но и саму возможность получения олигонуклеотида требуемой длины (таблица 1).

Длина олигонуклеотида Степень превращения на стадии конденсации
97% 98,5% 99,5%
10 76.0% 87.3% 95.6%
20 56.1% 75.0% 90.9%
50 22.5% 47.7% 78.2%
100 4.9% 22.4% 60.9%
150 1.1% 10.5% 47.4%
200 0.2% 4.9% 36.9%

Это обстоятельство ограничивает длину синтезируемого олигонуклеотида 200-250 звеньями [7]. Следует учесть, что таблица не учитывает других причин, приводящих к уменьшению выхода целевого олигонуклеотида – апуринизация, ветвление цепи и другие. Мы советуем ограничивать длину олигонуклеотида 100-120 звеньями, так как для синтеза более длинных олигонуклеотидов требуется оптимизировать объемы подаваемых реагентов и время протекания реакций, что осмысленно только при регулярном синтезе значительных количеств таких олигонуклеотидов. В большинстве случаев синтез нескольких коротких 5’-фосфорилированных фрагментов и последующее ферментативное лигирование дает аналогичные или лучшие результаты.

На каждой стадии конденсации небольшая часть 5'-гидроксильных групп (0.1-0.5%) остается не прореагировавшими и, чтобы предотвратить их участие в конденсации в следующем цикле синтеза, и, соответственно, образование олигонуклеотидов с делециями, требуется их блокирование. Для этого проводится ацилирование ангидридом, например, уксусным в присутствии основания и нуклеофильного катализатора. Эффективность кэпирования составляет около 91-94%, что достаточно в большинстве случаев, но для синтеза длинных олигонуклеотидов требуется изменение регламента синтеза.

На последней стадии проводят окисление полученной в результате конденсации межнуклеозидной фосфитной группы под действием раствора иода в тетрагидрофуране в присутствии пиридина и воды. Неполное окисление приводит к ветвлению олигонуклеотидной цепи, что неприемлемо для получения высококачественных олигонуклеотидов. После каждой стадии следует промывка твердофазного носителя ацетонитрилом для удаления остатков реагентов и продувка инертным газом для высушивания.

После окончания автоматизированного синтеза необходимо деблокировать олигонуклеотид с твердофазного носителя и удалить защитные группы с фосфатов и гетероциклических оснований. Чаще всего для этого используют водные растворы аммиака или смеси аммиак-метиламин (АМА). В зависимости от температуры варьируется время процедуры, для аммиака: 90ºС - 1 ч, 60ºС – 10-14 часов, комнатная температура-40ºС – 24 часа, для АМА – 65ºС – 30 минут, комнатная температура – 3 часа. Следует учесть, что повышенные температуры можно использовать только для праймеров, в случае модификаций (например, красителей) возможна деградация.

Химический синтез модифицированных олигонуклеотидов (зондов и других)

В настоящее время в современной клинической диагностике все большее распространение находят методы, требующие применение олигонуклеотидов, содержащих в своей структуре дополнительные модификации. Их можно условно разбить на четыре группы: флуоресцентные метки, тушители флуоресценции, аналоги нуклеотидов, прочие функциональные группы. Для введения модификаций используется три основных подхода: введение во время олигонуклеотидного синтеза в виде амидофосфитного производного (рис. 3А), использование производного, иммобилизованного на твердофазном носителе для введения 3’-модификации (рис. 3Б) и постсинтетическое введение модификации (рис. 3В, 3Г). Для использования первых двух вариантов необходимо, чтобы производное было устойчиво в условиях олигонуклеотидного синтеза и деблокирования. Третий вариант требует больших затрат времени, приводит к меньшим выходам целевого олигонуклеотида, но позволяет вводить производные, неустойчивые в щелочной среде, в присутствии кислот и окислителей.

В настоящее время коммерчески доступно большое количество амидофосфитных производных: флуоресцентных красителей (FAM, R6G, JOE, Cy3, TAMRA, Cy5), тушителей флуоресценции (BHQ-1, BHQ-2), реакционно-способных групп (алкин, амин, карбоксил, фосфат), биотина и других. Следует отметить, что в зависимости от структуры амидофосфитные производные позволяют вводить модификацию как на 5’- конец, так и в середину цепи или на 3’-конец. Использование амидофосфитов для 3’-модификации имеет смысл при редком синтезе таких олигонуклеотидов в небольших количествах, в других случаях проще и дешевле использовать твердофазный носитель с иммобилизованной молекулой. Так получают олигонуклеотиды, содержащие тушители флуоресценции (BHQ-1, 2, 3), амин, фосфат, алкин и другие модификации на 3'-конце. Следует отметить, что в случае модифицированных олигонуклеотидов не всегда возможно использование стандартных условий деблокирования и удаления защитных групп. Часто использование аммиака или метиламина невозможно и требует применения карбоната калия в метаноле или водного раствора трет-бутиламина. В ряде случаев и этого недостаточно, тогда необходимо использовать амидофосфиты 2’-дезоксинуклеозидов с лабильными защитами, которые удаляются в очень мягких условиях.

Постсинтетическая модификация применяется либо для присоединения молекул, неустойчивых в условиях олигонуклеотидного синтеза, деблокирования и удаления защит, либо для синтеза небольших количеств ограниченного набора олигонуклеотидов. Последнее оправдано экономически, так как при применении амидофосфитов в синтезаторе часть реагентов расходуется на заполнение и промывку каналов, что при синтезе 1-2 олигонуклеотидов зачастую составляет основную часть расходов. Известны олигонуклеотиды с разными реакционноспособными группами (амин, алкин, карбоксил, фосфат, малеимид, тиол), но наиболее часто используются первые две. Для этого синтезируют модифицированные олигонуклеотиды с использованием амидофосфитных производных содержащих защищенную аминогруппу или терминальный алкин. Так, олигонуклеотиды, содержащие аминогруппу, реагируют с активированными эфирами (рис. 3В), изотиоцианатами, альдегидами (например, поверхность микрочипов).

Реакция 1,3-диполярного присоединения алкинов с азидами (так называемая клик реакция, рис. 3Г) в последнее десятилетие стала крайне популярной из-за своей селективности, высоких выходов и независимости от рН. Так, для достижения степени превращения 95-98% в случае клик реакции достаточно 1.2-1.5 эквивалента азида и реакция проходит в течение 3 часов, в то время как ацилирование аминогруппы требует 15-20 эквивалентов сукцинимидного эфира и реакция идет в течение 18 часов. Возможно использование двух вариантов этой реакции: медь (I)-катализируемая реакция терминальных алкинов с азидами и прямое взамодействие конформационно-напряженных активированных циклооктинов с азидами [8]. Второй вариант актуален для модификации антител и других нестабильных биомолекул, а также для мечения белков/нуклеиновых кислот в клетках. Таким образом, ацилирование аминоолигонуклеотидов и клик-присоединение к олигонуклеотидам с терминальным алкином являются основными для введения родаминовых красителей (особенно ROX), цианиновых красителей (Су5, Су5.5), а также многих других производных.

Рисунок 3. Схемы применения А- амидофосфита биотина, Б- твердофазного носителя с иммобилизованным тушителем флуоресценции BHQ-1, В- сукцинимидного (активированного) эфира 5-карбокситетраметилродамина (TAMRA), Г- азида 5-карбоксиродамина 6Ж (R6G) для синтеза модифицированных олигонуклеотидов.

Флуоресцентные метки вводятся в структуру олигонуклеотидов для последующей детекции продуктов их амплификации или гибридизации с помощью флуориметров. Такой принцип детекции используется в методе ПЦР в реальном времени, секвенировании по Сэнгеру, фрагментном анализе, в микрочиповых технологиях и других приложениях. В настоящее время известно большое количество различных красителей, которые могут использоваться в качестве флуоресцентных меток для олигонуклеотидов. Ниже мы рассмотрим наиболее использующиеся варианты. Основными характеристиками таких красителей является длина волны света, при котором происходит максимальное возбуждение молекулы красителя (абсорбция) и длина волны, при которой происходит максимальное испускание фотонов (эмиссия). Помимо длины волны важной характеристикой флуоресцентных красителей является их квантовый выход. Чем выше квантовый выход, тем более интенсивный сигнал дает такой краситель, так как «яркость» является произведением коэффициента экстинкции и квантового выхода. Кроме того, с точки зрения практического применения важным свойством является химическая устойчивость красителей как в составе олигонуклеотидов, так и в условиях олигонуклеотидного синтеза. Так известно, что красители цианиновой группы (например, Сy3 и Су5) подвержены деградации под действием света и окислителей [9]. Кроме того цианиновые красители крайне нестабильны в условиях аммиачного деблокирования, что существенно снижает выход олигонуклеотидов с цианиновыми метками. Ксантеновые красители (например, FAM), напротив, отличаются хорошей стабильностью, как при хранении, так и в процессе олигонсинтеза. Ключевым параметром являются длины волн максимального поглощения и испускания, так как существующие в настоящее время приборы, предназначенные для работы с флуоресценто-меченными производными нуклеиновых кислот (амлификаторы в реальном времени, сканеры для микрочипов, капиллярные секвенаторы и др.), технологически сконструированы для работы с определенными длинами волн. Как правило, используются фильтры с шириной щели 10-20 нм, и краситель, спектр которого не совпадает с этими значениями, не может быть использован. Наиболее распространенные флуоресцентные красители и их характеристики приведены в таблице 2.

Таблица 2. Флуоресцентные красители для конъюгации с олигонуклеотидами и их спектральные характеристики.
аMax Ab – длина волны максимального поглощения, бMax Em - длина волны максимальной эмиссии, вне используется в количественном ПЦР.

Как отмечалось выше, выбор тех или иных красителей обусловлен спектральными характеристиками используемых приборов. Несмотря на постоянное развитие приборной базы можно выделить условно стандартные группы флуоресцентных красителей, которые подходят для большинства современных приборов. Так сканеры микрочипов, как правило, работают c флуоресцентными метками Су3 и Cy5. В капиллярных секвенаторах можно использовать коммерчески доступные метки FAM, JOE, TAMRA, ROX [10], более современные приборы работают с использованием кассет флуоресцентных красителей. В секвенаторах компаний LI-COR Biosciences и Beckman Coulter распространение получили метки инфракрасного диапазона, например, IRDye700 и IRDye800 или серия WellRed.

В ПЦР в реальном времени все большое распространение получают пяти- и даже шестиканальные амплификаторы, которые работают с метками Alexa 350, FAM, HEX (R6G, VIC, JOE), ROX, Cy5 и Су5.5 (Rotorgene Q 6plex, Stratagene 3005P). Следует отметить, что также существует тенденция создания приборов с спектральными характеристиками отличными от «стандартных». Так, приборы выпускаемые под брендом Applied Biosystems компанией Life Technologies сконструированы под оптимальную работу с патентованными флуоресцентными метками VIC, NED, TAZ, SID, PET, LIS. Учитывая, что такие красители коммерчески не доступны, пользователь вынужден работать только с оригинальными наборами реагентов производства Life Technologies. Решением в такой ситуации может быть использование линеек коммерческих красителей, которые покрывают весь диапазон излучения (350 - 750 нм), например, красители AlexaFluor, ATTO-TEC, Dyomics и другие. Хотя такие красители обладают широким спектральным диапазоном и зачастую лучшим квантовым выходом или лучшей химической стабильностью, часто их использование также ограничено более высокой, чем для стандартных красителей стоимостью.

В количественном ПЦР (в реальном времени) используются флуоресцентные зонды, представляющие собой олигонуклеотид, содержащий одновременно две модификации - флуоресцентный краситель и тушитель флуоресценции. Тушитель предназначен для того, чтобы минимизировать исходное (фоновое) значение флуоресценции зонда, во время амплификации происходит гидролиз зонда и разгорание флуоресценции из-за того, что краситель и тушитель свободно диффундируют в раствор [11]. Как правило, вторичная структура олигонуклеотида сконструирована таким образом, что изначально 5’- и 3’-концы пространственно сближены, что обеспечивает эффективное контактное тушение. Если создание такой структуры невозможно, то тушитель флуоресценции вводится в середину олигонуклеотидной цепи, что позволяет обеспечивать эффективное тушение за счет резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). При этом 3’-гидроксильная группа в составе олигонуклеотида должна быть блокирована фосфатом или любой другой модификацией, чтобы избежать элонгирования зонда при амплификации. В качестве тушителей флуоресценции чаще всего используются тушители семейства Black Hole Quencher (BHQ). В таблице 2 приведены варианты комбинирования флуоресцентных красителях с тушителями.

Среди химических модификаций отдельное место занимают модифицированные аналоги нуклеотидов, позволяющие уменьшать, либо увеличивать специфичность взаимодействия олигонуклеотида с НК-мишенью. Уменьшение специфичности необходимо при одновременной амплификации/детекции НК близкородственных организмов, незначительно отличающих по первичной структуре – однобуквенные замены, делеции, вставки и аналогичные отличия. Несмотря на то, что возможен синтез вырожденных олигонуклеотидов, которые представляют собой смесь гомологичных олигонуклеотидов, содержащих набор однобуквенных замен в определенных положениях, в ряде случаев используют так называемые универсальные нуклеотиды. Наиболее известный пример – 2’-дезоксиинозин, который образует комплементарные пары со всеми четырьмя природными нуклеотидами со схожей стабильностью. Также известны синтетические аналоги гетероциклических оснований – 5-нитроиндол и 3-нитропирол, которые образуют одинаково стабильные комплементарные пары со всеми четырьмя природными нуклеотидами и, в отличие от инозина, при многократном введение в олигомерную цепь позволяют получать дуплексы с предсказуемой стабильностью. Противоположная ситуация, когда требуется селективно амплифицировать/детектировать фрагмент ДНК, содержащий SNP (однобуквенную замену), решается с использованием модификаций, чувствительных к некомплементарным парам. Наиболее известный пример – конформационно-блокированные нуклеотиды (так называемые LNA или BNA), которые не только селективно образуют комплементарные пары, но и значительно увеличивают их термодинамическую стабильность, по сравнению с природным вариантом. Это позволяет создавать более короткие праймеры и зонды, что также способствует специфичности амплификации и, кроме того, может быть использовано для амплификации сильно структурированных РНК [12]. Стоит также упомянуть, что LNA широко применяются в синтезе олигонуклеотидов для создания терапевтических средств.

Среди остальных модификаций, применяемых в синтезе олигонуклеотидов можно выделить фосфат, тиофосфат и тиол, которые используются для последующей конъюгации с другими молекулами. Так как биотин образует стабильные комплексы с авидином и стрептавидином, то это свойство широко используется для иммобилизации олигонуклеотидов на поверхностях и для мечения. Несмотря на то, что тиофосфатную группу можно использовать для конъюгации с иодоацетамидами, чаще ее применяют для увеличения стабильности олигонуклеотидов к действию нуклеаз. Это используется для синтеза терапевтических олигонуклеотидов, молекулярных маячков для детекции мРНК в клеточной культуре, а также для получения одноцепочечной ДНК в результате гидролиза одной цепи после амплификации, когда один праймер модифицирован.

Представленные методы позволяют эффективно синтезировать модифицированные праймеры и зонды для ПЦР. Также существует большое количество альтернативных подходов, но они гораздо реже используются из-за меньшей универсальности.

Список литературы

  1. C.B.Reese. Oligo- and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org. Biomol. Chem. 3 (21) 3851-3868 (2005).
  2. A.M.Michelson, A.R.Todd. Nucleotides part XXXII. Synthesis of a dithymidine dinucleotide containing a 3’-5’-internucleotidic linkage. J. Chem. Soc. 2632-2638 (1955).
  3. P.T.Gilham, H.G.Khorana. Studies on polynucleotides. I. A new and general method for the chemical synthesis of the C5’-C3’ internucleotidic linkage. Syntheses of deoxyribo-dinucleotides. J. Am. Chem. Soc. 80 (23) 6212-6222 (1958).
  4. G.Alvarado-Urbina, G.M.Sathe, W.C.Liu, M.F.Gillen, P.D.Duck, R.Bender, K.K.Ogilvie. Automated synthesis of gene fragments. Science 214 (4518) 270-274 (1981).
  5. S.Kosuri, G.M.Church. Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications. Nat. Methods 11 (5), 499-507 (2014).
  6. S.L.Beaucage, M.H.Caruthers. Deoxynucleoside phosphoramidites - a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
  7. S.L.Beaucage, R.P.Iyer. Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron 48 (12), 2223-2311 (1992).
  8. А.В.Устинов, И.А.Степанова, В.В.Дубнякова, Т.С.Зацепин, Е.В.Ножевникова, В.А.Коршун. Модификация нуклеиновых кислот с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения азидов и алкинов. Биоорган. химия 36 (4), 437–481 (2010).
  9. T.L.Fare, E.M.Coffey, H.Dai, Y.D. He, D.A.Kessler, K.A.Kilian, J.E.Koch, E.LeProust, M.J.Marton, M.R.Meyer, R.B.Stoughton, G.Y.Tokiwa, Y.Wang. Effects of atmospheric ozone on microarray data quality.Anal. Chem. 75 (17), 4672-4675 (2003).
  10. B.K.Nunnally, H.He, L.C.Li, S.A.Tucker, L.B.McGown. Characterization of visible dyes for four-decay fluorescence detection in DNA sequencing. Anal. Chem. 69 (13), 2392-2397 (1997).
  11. P.M.Holland, R.D.Abramson, R.Watson, D.H.Gelfand. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’-3’ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88(16), 7276–7280 (1991).
  12. A.Fratczak, R.Kierzek, E.Kierzek. LNA-modified primers drastically improve hybridization to target RNA and reverse transcription. Biochemistry 48(3), 514-516 (2009).

Наша технология работы

Научная база, накопленный опыт и техническое оснащение, позволяют быстро оптимизировать наши технологии под индивидуальные решения в области олигосинтеза.

Заказ
Оформление
Доставка

Контакты

Если вы хотите отправить нам сообщение, воспользуйтесь формой обратной связи или просто позвоните нам.

129085, Москва, ул. Годовикова, д.9, стр. 1, подъезд 1.4, помещение 1.12

+7 495 721-29-70, +7 929 692-58-64

info@genterra.ru

www.genterra.ru

Top