Ферменты для полимеразной цепной реакции (ПЦР) играют ключевую роль в амплификации ДНК. Основным ферментом, используемым в ПЦР, является ДНК-полимераза, которая синтезирует новые цепи ДНК, используя существующую цепь в качестве шаблона. Вот несколько основных типов ферментов, используемых в ПЦР:
· Термостабильные ДНК-полимеразы: Эти ферменты устойчивы к высоким температурам, что позволяет им работать в условиях денатурации (обычно при 94-98 °C). Примером является Taq-полимераза, выделенная из термофильной бактерии Thermus aquaticus.
· Высокоточные ДНК-полимеразы: Эти ферменты, такие как Pfu-полимераза, обладают высокой процессуальной точностью и способны исправлять ошибки, что делает их идеальными для амплификации, требующей высокой специфичности.
· ДНК-полимеразы с экзонуклеазной активностью: Некоторые полимеразы, такие как Phusion, имеют экзонуклеазную активность, что позволяет им удалять неправильно вставленные нуклеотиды, повышая точность амплификации.
· Реверс-транскриптазы: Эти ферменты используются для синтеза кДНК из РНК, что позволяет проводить ПЦР на образцах РНК. Примером является M-MLV реверс-транскриптаза.
- Специальные термостабильные ДНК-полимеразы, такие как Bst-полимераза для LAMP, которые могут работать при постоянной температуре.
Для проведения ПЦР также могут использоваться следующие реагенты:
· Буферные растворы: Буферы, которые обеспечивают оптимальные условия для работы ферментов, включая pH и ионную силу. Они могут содержать соли, такие как KCl или NaCl, и другие компоненты, которые поддерживают активность ферментов.
· ДНК или РНК-шаблоны: Исходные нуклеиновые кислоты, которые будут амплифицированы. Это может быть ДНК или кДНК, полученная из РНК.
· ДНК-нуклеотиды (dNTPs): Смесь дезоксирибонуклеотидов (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), которые необходимы для синтеза новых цепей ДНК.
· Ко-факторы: Некоторые ферменты могут требовать наличия ко-факторов, таких как Mg²⁺, для своей активности. Эти ионы обычно добавляются в буферный раствор.
· Ингибиторы и стабилизаторы: В некоторых случаях могут использоваться ингибиторы для предотвращения нежелательных реакций или стабилизаторы для увеличения срока хранения реагентов.