Молекулярное клонирование — это группа методов, заключающихся в изолировании фрагмента ДНК, его встраивании в вектор и последующем получении множества копий этой рекомбинантной молекулы ДНК. Наиболее часто в качестве векторов используют плазмиды – кольцевые двуцепочечные молекулы ДНК, которые характеризуются небольшим размером, наличием маркеров, по которым можно проводить отбор рекомбинантных молекул, а также обладающие последовательностями уникальных сайтов рестрикции. Плазмидные конструкции, содержащие целевой фрагмент, находят широкое применение в различных областях молекулярной биологии, и могут быть использованы как положительные контроли для ПЦР, для клонирования генов-интереса и последующего определения уровня экспрессии, для получения рекомбинантных белков и для других целей.
В настоящее время наиболее часто используют следующие методы клонирования: традиционное клонирование, TA-клонирование, бесшовное клонирование (сборка по Гибсону и технология Golden Gate) и безлигазное клонирование. Каждый из перечисленных методов обладает различными подходами к получению рекомбинантной ДНК, однако можно выделить 4 базовых этапа клонирования:
АО ГенТерра предлагает свои услуги по созданию рекомбинантных плазмид каждым из перечисленных методов клонирования.
Ключевой особенностью данного метода является использование ферментов рестрикции и T4 ДНК-лигазы («cut-and-paste» подход) (рис.1).
Рисунок 1. Схема традиционного клонирования
На первом этапе необходимо амплифицировать фрагмент ДНК, который в дальнейшем будет клонирован в вектор. Для традиционного клонирования на концы последовательности праймеров добавляются уникальные сайты рестрикции. Важно проверить последовательность вставки на отсутствие сайтов, которые планируется использовать в эксперименте, чтобы избежать нецелевого разрезания целевой последовательности. После проведения ПЦР рекомендуется выполнить очистку ампликона для повышения эффективности следующего этапа.
Далее вектор и вставка обрабатываются ферментами рестрикции. Рестрикционные эндонуклеазы образуют либо «липкие» концы, в которых фрагмент ДНК имеет 3'- или 5'-одноцепочечный конец, либо «тупые» концы, в которых одноцепочечный конец отсутствует. Если вектор линеаризуется одной эндонуклеазой рестрикции, необходима его обработка щелочной фосфатазой, которая предотвращает лигирование векторных молекул самих на себя за счет отщепления 5'- и 3'-фосфатных групп. Кроме того, липкие концы можно преобразовать в тупые концы путем добавления недостающих нуклеотидов или за счет удаления выступающих концов с помощью Фрагмента Кленова или T4 ДНКполимеразы.
После обработки специфичными эндонуклеазами рестрикции проводят соединение концов вектора и вставки с помощью T4 ДНК-лигазы. Следующим этапом является трансформация лигазной смесью компетентных клеток E. coli и их культивирование в селективных условиях. Для отбора клонов, потенциально содержащих целевую вставку, проводится ПЦР с колоний. Для экономии времени при раскапывании, а также снижения вероятной контаминации используют готовые смеси для ПЦР.
Завершающим этапом клонирования является выделение плазмидной ДНК из клонов, положительных при отборе. По желанию выделенные плазмиды отправляют на секвенирование по Сэнгеру для подтверждения целевой последовательности ДНК.
Традиционное клонирование позволяет создать практически любую конструкцию с целевой вставкой, будь то короткая последовательность гидовой РНК или ген размером в несколько килобаз. Доступность широкого ассортимента ферментов и множество адаптированных для различных целей протоколов делают такое клонирование практически универсальным инструментом. Однако сайтымишени ферментов рестрикции могут повторяться в определенной последовательности ДНК, что может привести к появлению нежелательных фрагментов ДНК меньшего размера. Поэтому данный метод требует внимательного анализа клонируемых последовательностей.
Ключевой особенностью данного метода является прямое лигирование фрагмента ДНК, полученного в результате ПЦР, без использования рестрикционных ферментов (рис. 2).
Рисунок 2. Схема ТА-клонирования
Для наработки ПЦР-продукта используют Taq-полимеразу, добавляющую остаток аденина (A) на 3'-концы фрагментов ДНК во время процесса амплификации. Следует учитывать, что использование высокоточных полимераз, создающих ПЦРпродукты с тупыми концами, приведет к существенному снижению эффективности ТА-клонирования.
После очистки ПЦР-ампликона проводится его лигирование в вектор, содержащий на 3'-конце остаток тимина (Т). Дальнейшие этапы получения рекомбинантных молекул проходят также, как и в традиционном клонировании – выполняется трансформация компетентных клеток лигазной смесью, скрининг колоний для отбора клонов с целевой последовательностью и выделение плазмидной ДНК.
TA-клонирование обладает преимуществом за счет простоты и скорости получения рекомбинантной ДНК, поскольку не требует этапа обработки эндонуклеазами рестрикции. Данный метод подходит для клонирования в случае наличия внутреннего сайта рестрикции во вставке ДНК. Недостатком технологии TAклонирования является то, что целевая последовательность может быть вставлена в вектор как в прямой, так и в обратной ориентации. Если предполагается использовать рекомбинантную плазмиду как положительный контроль для ПЦР, то ориентация вставки не важна. В случае, если вставка будет перенесена в другой вектор для экспрессии под определенным промотором, то прямая ориентация вставки имеет ключевое значение. Другим ограничением является необходимость использования специализированных плазмид, несущих остаток тимина, что требует дополнительного приобретения данных векторов.
Бесшовное клонирование представляет собой группу методов, которые позволяют объединять несколько фрагментов ДНК в определенном линейном порядке в вектор за один этап.
Ключевой особенностью данного метода является возможность синтеза множественных вставок ДНК с помощью рестрикционных ферментов типа II (рис. 3).
Рисунок 3. Схема клонирования Golden Gate
Все фрагменты, а также вектор должны быть фланкированы сайтом узнавания для рестрикционного фермента типа II (например, BsaI или BbsI). Для этого на концы праймеров добавляются сайты узнавания этих эндонуклеаз рестрикции, а затем проводится ПЦР для получения целевых фрагментов и вектора. Ферменты типа II уникальны по сравнению с традиционными эндонуклеазами рестрикции тем, что они расщепляют ДНК за пределами своего сайта узнавания, создавая липкие концы с четырьмя основаниями. Для успешного применения технологии Golden Gate необходимо, чтобы выступающие части обладали уникальными и комплементарными последовательности, что позволит объединить фрагменты ДНК в одну рекомбинантную плазмиду.
После амплификации фрагментов ДНК и вектора, каждый компонент необходимо очистить, а затем объединить в одну реакцию, добавив необходимую эндонуклеазу рестрикции и T4 ДНК-лигазу, и провести сборку плазмиды в амплификаторе. Далее проводится этап трансформации. ПЦР с колоний, а также рестрикционный анализ позволят обнаружить корректную сборку среди разного варианта сборок рекомбинантной плазмиды. Также рекомендуется провести секвенирование по Сэнгеру, уделяя особое внимание местам отжига разных фрагментов.
Благодаря технологии Golden Gate появилась возможность сборки более 20 фрагментов, а также клонирования сложных конструкций. Это быстрый способ, позволяющий выполнить всю стадию клонирования (этап рестрикции и лигирования) за одну реакцию. Среди ограничений выделяют требование к отсутствию сайтов узнавания для ферментов II-типа внутри всех фрагментов ДНК, участвующих в сборке.
Ключевой особенностью данного метода является возможность синтеза множественных вставок ДНК за счет использования трех распространенных ферментов молекулярной биологии: 5'-экзонуклеазы, полимеразы и лигазы (рис. 4).
Рисунок 4. Схема сборки по Гибсону
В сборке Гибсона фрагменты ДНК с гомологией 15-30 пар оснований на концах могут быть лигированы вместе в одной изотермической реакции. Сначала 5'- экзонуклеаза расщепляет 5'-концы целевых фрагментов ДНК, образуя длинные выступы, которые отжигаются друг с другом из-за их гомологии. Затем ДНКполимераза закрывает бреши, созданные 5'-экзонуклеазой, и, наконец, лигаза сшивает разрывы в ДНК, создавая один фрагмент двухцепочечной ДНК.
Праймеры для амплификации ДНК фрагментов подбираются таким образом, чтобы их 5'-конец был гомологичен соседнему сегменту, а 3'-конец соответствовал целевой последовательности. Для амплификации фрагментов рекомендуется использовать высокоточную ДНК-полимеразу для снижения образования потенциальных мутаций. Вектор может быть линеаризован как с помощью ПЦР, так и посредством обработки ферментами рестрикции. Следующие этапы аналогичны технологии Golden Gate: после получения всех фрагментов проводят их очистку, а затем объединяют в одной реакции и добавляют буфер, содержащий 5'- экзонуклеазу, полимеразу и лигазу. Далее проводится трансформация компетентных клеток E. coli и валидация рекомбинантной плазмиды.
Сборка по Гибсону позволяет легко собирать несколько фрагментов ДНК в нужной ориентации за один этап, однако следует избегать вторичных структур в гомологичных последовательностях, поскольку их наличие может привести к снижению эффективности клонирования.
Ключевой особенностью данного метода является использование 3'-5' экзонуклеазной активности Т4 ДНК-полимеразы, позволяющей соединять вектор и вставку без ДНК-лигазы (рис. 5).
Рисунок 5. Схема безлигазного клонирования
Вектор для безлигазного клонирования обрабатывается рестрикционным ферментом типа II (например, BsaI), что позволяет получить линеаризованный вектор с выступающими концами. Для дальнейшей работы требуется провести очистку вектора из геля, чтобы избавиться от фермента и компонентов, присутствующих в реакционной смеси. Далее линеаризованная плазмида обрабатывается T4 ДНК-полимеразой в присутствии dNTP, например, dСTP, который переключает экзонуклеазную активность фермента на полимеразную. Так, T4 полимераза будет удалять основания с 3'-конца сайта разрезания до тех пор, пока не достигнет первого цитозина в цепи ДНК, после чего благодаря полимеразной активности добавит удаленную С и остановится.
Для амплификации матрицы подбираются праймеры, несущие гомологичную последовательность вектора на 5'-конце. Длина гомологичного фрагмента зависит от размера последовательности, которую T4 ДНК-полимераза удалит из линеаризованной плазмиды (обычно 10-15 пар нуклеотидов). После очистки ПЦРампликон обработывают с помощью T4 ДНК-полимеразы в присутствии другого dNTP (в нашем случае – dGTP). Полученная вставка будет иметь выступающий 5'- конец, который гибридизуется с 3'-концом обработанного вектора. Окончательная сборка рекомбинантной плазмиды происходит после трансформации, когда системы репарации бактерии-хозяина восстанавливают одноцепочечные разрывы ДНК.
Безлигазное клонирование относится к быстрому и простому методу за счет отсутствия классического этапа лигирования, а также использования только одного фермента рестрикции (это может быть выгодно, когда в последовательности вставки содержатся несколько сайтов рестрикции, поэтому проблема выбора эндонуклеаз рестрикции, которые бы не разрезали интересующий ген, отпадает). Однако эффективность безлигазного клонирования значительно снижается при клонировании фрагментов, которые заканчиваются последовательностями, образующими сложные вторичные структуры.
Технология молекулярного клонирования постоянно совершенствуется, позволяя сделать процесс получения рекомбинантных молекул проще, быстрее и дешевле. Существующие методы клонирования имеют свои специфические преимущества и недостатки, при этом каждый из них находит свое применение в исследованиях и биотехнологии. АО ГенТерра предлагает широкий ассортимент ферментов, реагентов и наборов, необходимых для качественного выполнения каждого этапа молекулярного клонирования.
